Identifizierung, Sortierung und Profilierung funktioneller Killerzellen durch die Erfassung fluoreszierender Zielzellen

Nature Biomedical Engineering (2023)Diesen Artikel zitieren

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Assays zur Beurteilung der zellvermittelten Zytotoxizität sind größtenteils auf Zielzellen ausgerichtet und können keine Subpopulationen zytotoxischer Effektorzellen identifizieren und isolieren. Hier beschreiben wir einen mit der Durchflusszytometrie kompatiblen Assay zur genauen Identifizierung und Sortierung funktioneller Killerzell-Subpopulationen in Co-Kulturen. Der Assay, den wir PAINTKiller (für „Proximity Affinity Intrazelluläre Transferidentifizierung von Killerzellen“) genannt haben, basiert auf dem Nachweis eines intrazellulären fluoreszierenden Proteins, das von einer lysierten Zelle auf die Oberfläche der lysierenden zytotoxischen Zelle (insbesondere auf die Zelle) „gemalt“ wird Durch Lyse wird das intrazelluläre Fluorescein-Derivat Carboxyfluorescein-Succinimidylester auf der Oberfläche der natürlichen Killerzelle durch einen Antikörper für Anti-Fluorescein-Isothiocyanat gebunden, der mit einem Antikörper für den Pan-Leukozyten-Oberflächenrezeptor CD45 verknüpft ist. Der Assay kann in die Einzelzell-RNA-Sequenzierung integriert werden, um molekulare Signalwege zu analysieren, die mit Zellzytotoxizität in Zusammenhang stehen, und kann zur Aufdeckung von Korrelaten funktioneller Immunantworten verwendet werden.

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Kuratierte Hallmark-Gensätze sind öffentlich in der Molecular Signatures Database (MSigDB, v.7.4) verfügbar. Sequenzierungsdaten von PAINTKiller-seq sind in der GEO-Datenbank unter der Zugangsnummer GSE207508 verfügbar. Alle Daten, die zur Bewertung der in diesem Dokument beschriebenen Schlussfolgerungen erforderlich sind, sind im Dokument und in den Zusatzinformationen enthalten. Die im Rahmen der Studie generierten Rohdaten und analysierten Datensätze stehen auf begründete Anfrage für Forschungszwecke bei den entsprechenden Autoren zur Verfügung. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der R-Code zur Reproduktion der in den Abbildungen dargestellten Analysen ist auf Zenodo unter https://doi.org/10.5281/zenodo.8004120 verfügbar.

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Wir danken dem Flow Cytometry Laboratory (NUS Medical Sciences Cluster) für die technische Unterstützung bei der Zellsortierung. LFC wurde für die in dieser Studie beschriebene Forschung vom National Medical Research Council (MOH-OFIRG18nov-003), dem Bildungsministerium von Singapur (MOE-T2EP30120-0008) und der Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Critical Analytics for Manufacturing unterstützt Interdisziplinäre Forschungsgruppe für personalisierte Medizin (SMART CAMP).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yen Hoon Luah, Tongjin Wu.

Institut für Gesundheitsinnovation und -technologie, National University of Singapore, Singapur, Singapur

Yen Hoon Luah, Tongjin Wu und Lih Feng Cheow

Kritische Analytik für die Herstellung personalisierter Medizin, interdisziplinäre Forschungsgruppe, Singapore-MIT Alliance in Research and Technology, Singapur, Singapur

Yen Hoon Luah und Lih Feng Cheow

Abteilung für Biomedizintechnik, College of Design and Engineering, National University of Singapore, Singapur, Singapur

Tongjin Wu & Lih Feng Cheow

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LFC, YHL und TW konzipierten und gestalteten die Studie. TW führte die den Abbildungen entsprechenden Experimente durch. 2, 4 und 7. YHL führte die Experimente entsprechend Abb. 3 durch. TW und LFC führten die PAINTKiller-seq-Datenanalyse durch. LFC, TW und YHL haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren kommentierten das Manuskript und stimmten der Einreichung zu.

Korrespondenz mit Lih Feng Cheow.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Biomedical Engineering dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a: Ungefilterte Genexpressionsdaten aus zwei Sequenzierungsspuren („Exp. 1“ und „Exp. 2“). Zellen mit den folgenden Kriterien wurden für die nachgeschaltete Analyse gefiltert: Genzahlen > 1.200 und < 8.000, Genexpressionszahlen > 1.000 und < 40.000, mitochondriale Gene < 10 % der insgesamt erkannten Gene. b, Die Zellproben, einschließlich der NK-K562-Co-Kulturgruppe („NK + K562“), der Nur-NK-Gruppe („Nur NK“) und der Isotyp-Färbungskontrolle („Isotyp-Strg“), wurden anhand ihrer Anti-Färbeintensität demultiplext -β2M Hashtags. Die Zellennummern für jede Gruppe wurden in Klammern angezeigt.

a, b, Zellen wurden anhand ihrer Transkriptionsprofile geclustert (a) und Nicht-NK-Zellen wurden entsprechend der Expression linienassoziierter Gene wie CD3E für T-Zellen und HBA1/HBA2 für K562-Zellen ausgeschlossen (b). c, NK-Zellen wurden nach ihren Transkriptionsprofilen neu gruppiert. Insgesamt wurden 13 Cluster identifiziert. Cluster 6 und 7 wurden hauptsächlich in NK-Proben gefunden, die zusammen mit K562-Zellen kultiviert wurden.

Ergänzende Abbildungen und Tabellen.

Quelldaten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Luah, YH, Wu, T. & Cheow, LF Identifizierung, Sortierung und Profilierung funktioneller Killerzellen durch Einfangen von fluoreszierendem Zielzelllysat. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01089-z

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Eingegangen: 15. Juli 2022

Angenommen: 04. August 2023

Veröffentlicht: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01089-z

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